琥珀酸脫氫酶（Succinate dehydrogenase，簡(jiǎn)稱(chēng)SDH），黃素酶類(lèi)，屬于細(xì)胞色素氧化酶，是TCA循環(huán)中唯.一一個(gè)整合于膜上的多亞基酶，在真核生物中，結(jié)合于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，在原核生物中整合于細(xì)胞膜上，其是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細(xì)胞線(xiàn)粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線(xiàn)粒體的一種標(biāo)志酶。
提取
琥珀酸脫氫酶的提取與生理意義
琥珀酸脫氫酶存在于所有有氧呼吸細(xì)胞，和線(xiàn)粒體膜牢固結(jié)合，是三羧酸循環(huán)中唯.一與內(nèi)膜結(jié)合的酶，是脫氫酶中最重要的酶。迄今為止，已從多種原核和真核組織中分離純化出這種酶，為該酶的酶學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。作為膜內(nèi)酶，琥珀酸脫氫酶與具有脂雙層結(jié)構(gòu)的線(xiàn)粒體膜結(jié)合得比較緊密，很難溶解下來(lái)，而且其一旦離開(kāi)膜后，暴露在空氣中會(huì)很快失活，因此其提純難度很大。1950年我國(guó)著名生物化學(xué)家王應(yīng)睞、鄒承魯、汪靜英等開(kāi)展對(duì)膜蛋白琥珀酸脫氫酶的研究，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脫氫酶從鼠肝組織線(xiàn)粒體膜上溶解下來(lái)，得到了高純度的水溶性琥珀酸脫氫酶，其活力比同期國(guó)外報(bào)道者高出1倍以上，從而奠定了我國(guó)在琥珀酸脫氫酶研究領(lǐng)域的領(lǐng).先地位。其后，Davis等（1971、1977）使用NaClO4從牛心線(xiàn)粒體溶解下此酶；TsukahoHattori和TadashiAsahi（1982）選用離子型去垢劑脫氧膽酸鈉從番薯根線(xiàn)粒體提取SDH；Suraveratum等（2000）對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的琥珀酸脫氫酶進(jìn)行了純化；夏玉鳳等（2000）以玉米黃化苗為生物材料，通過(guò)差速離心獲得線(xiàn)粒體，使用超聲波將其破碎，用2%TritonX-100溶膜，超速離心，硫酸銨沉淀，DEAE-C32層析純化琥珀酸脫氫酶；辛明秀等（2004）用常規(guī)酶學(xué)方法從嗜冷酵母（Y18）中分離純化出有催化活性的琥珀酸脫氫酶。
琥珀酸脫氫酶是直接連在電子傳遞鏈上的，氫受體是FAD而不是NAD+，它使琥珀酸氧化為延胡索酸過(guò)程中所產(chǎn)生的FADH2與酶結(jié)合，將來(lái)自FADH2的兩個(gè)電子直接傳遞給酶的Fe3+?，F(xiàn)有研究表明，琥珀酸脫氫酶由α、β兩個(gè)亞基組成，α亞基相對(duì)分子質(zhì)量為70.0×103，含有FAD和兩個(gè)鐵硫簇；β亞基相對(duì)分子質(zhì)量為27.0×103，含有一個(gè)鐵硫簇。
測(cè)定
琥珀酸脫氫酶活力測(cè)定方法主要有五種。
硫酸甲酯吩嗪（PMS）反應(yīng)法
琥珀酸脫氫酶能通過(guò)一系列人工電子受體，如與PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等發(fā)生反應(yīng)催化琥珀酸的氧化，而借助這些中間產(chǎn)物的顏色變化，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)即可加以定量反映，其反應(yīng)式為：①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2；②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈藍(lán)色，標(biāo)準(zhǔn)的吸收光譜在600nm處，這種色澤可因其還原而漸次變淡，從而600nm處的光密度的變化與DCPIP含量成正比，測(cè)定2.6-DPIP的還原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被還原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可測(cè)定此反應(yīng)系統(tǒng)在600nm處的吸收光度變化，來(lái)計(jì)算SDH的活性。SDH活性計(jì)算：（標(biāo)準(zhǔn)－測(cè)定）/標(biāo)準(zhǔn)=μmol/min/mg。
鐵氰.化鉀[K3Fe（CN）6]還原法
以鐵氰.化鉀[K3Fe（CN）6]和琥珀酸鈉為底物，使琥珀酸脫氫酶催化反應(yīng)將鐵氰化.鉀還原為亞鐵氰.化鉀[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再與Fe3+作用生成普魯士藍(lán)，在700nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，以檢測(cè)普魯士藍(lán)之生成量，作為琥珀酸脫氫酶的還原力，吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活力愈強(qiáng)。
TTC（氯化三苯四氮唑）法
無(wú)色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作為人造受氫體，它在細(xì)胞呼吸過(guò)程中接受氫，還原成三苯基甲膳（TF）。后者以紅色晶體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，采用有機(jī)溶劑（如甲苯、乙.酸乙醋、三.氯甲烷、丙酮或乙醇等）進(jìn)行萃取。萃取液測(cè)定485nm吸光度后，以TTC還原量表示脫氫酶活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算TF生成量，進(jìn)而求出TTC-脫氫酶活性。
MTT法
MTT是一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線(xiàn)粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色.素C的作用下生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜（Formazana），經(jīng)異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度570nm處OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。
NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）法
NBT易溶于水，呈淡黃色，以NBT為受氫體，接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進(jìn)而形成紫藍(lán)色的沉淀，于反應(yīng)體系中加入PMS，混勻，37℃保溫30min，之后加入TCA終止反應(yīng)。加異丙醇溶解顯色，混勻，即可于548nm測(cè)OD值。規(guī)定：30min內(nèi)548nm下OD值為1.0時(shí)的酶量為1個(gè)活力單位。比活力=活力單位數(shù)/毫克蛋白。
